IPTG-ն (իզոպրոպիլ-β-D-թիոգալակտոզիդ) β-գալակտոզիդազի սուբստրատի անալոգ է, որը բարձր ինդուկտիվություն ունի։ IPTG-ի ինդուկցիայի ժամանակ ինդուկտորը կարող է կոմպլեքս առաջացնել ռեպրեսոր սպիտակուցի հետ, որի արդյունքում փոխվում է ռեպրեսոր սպիտակուցի կոնֆորմացիան, այնպես որ այն չի կարող միացվել թիրախային գենի հետ, և թիրախային գենը արդյունավետորեն էքսպրեսիայի է ենթարկվում։ Այսպիսով, ինչպե՞ս պետք է որոշվի IPTG-ի կոնցենտրացիան փորձի ընթացքում։ Որքան մեծ է, այնքան լավ։
Նախ, եկեք հասկանանք IPTG ինդուկցիայի սկզբունքը. E. coli-ի լակտոզային օպերոնը (տարրը) պարունակում է երեք կառուցվածքային գեներ՝ Z, Y և A, որոնք համապատասխանաբար կոդավորում են β-գալակտոզիդազը, պերմեազը և ացետիլտրանսֆերազը: lacZ-ը հիդրոլիզացնում է լակտոզան՝ վերածելով գլյուկոզի և գալակտոզի, կամ ալոլակտոզայի. lacY-ը թույլ է տալիս շրջակա միջավայրի լակտոզային անցնել բջջային թաղանթով և մտնել բջիջ. lacA-ն փոխանցում է ացետիլային խումբը ացետիլ-CoA-ից β-գալակտոզիդի, ինչը ներառում է թունավոր ազդեցության վերացումը: Բացի այդ, կա օպերացիոն հաջորդականություն O, մեկնարկային հաջորդականություն P և կարգավորող գեն I: I գենի կոդը ռեպրեսոր սպիտակուց է, որը կարող է կապվել օպերատորային հաջորդականության O դիրքի հետ, որպեսզի օպերոնը (մետա) ճնշվի և անջատվի: Կա նաև կապող տեղամաս կատաբոլիկ գենի ակտիվատոր սպիտակուց-CAP կապող տեղամասի համար՝ սկզբնական հաջորդականություն P-ից վերև: P հաջորդականությունը, O հաջորդականությունը և CAP կապող տեղամասը միասին կազմում են lac օպերոնի կարգավորող շրջանը: Երեք ֆերմենտների կոդավորող գեները կարգավորվում են նույն կարգավորող շրջանով՝ գենային արգասիքների համակարգված արտահայտումն ապահովելու համար։
Լակտոզայի բացակայության դեպքում lac օպերոնը (մետա) գտնվում է ռեպրեսիայի վիճակում։ Այս պահին PI պրոմոտոր հաջորդականության վերահսկողության տակ գտնվող I հաջորդականությամբ արտահայտված lac ռեպրեսորը կապվում է O հաջորդականության հետ, ինչը կանխում է ՌՆԹ պոլիմերազի կապը P հաջորդականության հետ և արգելակում տրանսկրիպցիայի նախաձեռնումը. երբ լակտոզան առկա է, lac օպերոնը (մետա) կարող է ինդուկցվել։ Այս օպերոնային (մետա) համակարգում իրական ինդուկտորը լակտոզան չէ։ Լակտոզան մտնում է բջիջ և կատալիզացվում է β-գալակտոզիդազի կողմից՝ վերածվելով ալոլակտոզի։ Վերջինս, որպես ինդուկտոր մոլեկուլ, կապվում է ռեպրեսոր սպիտակուցի հետ և փոխում սպիտակուցի կոնֆորմացիան, ինչը հանգեցնում է ռեպրեսոր սպիտակուցի դիսոցացիային O հաջորդականությունից և տրանսկրիպցիայից։ Իզոպրոպիլթիոգալակտոզիդը (IPTG) ունի նույն ազդեցությունը, ինչ ալոլակտոզը։ Այն շատ հզոր ինդուկտոր է, որը չի նյութափոխանակվում մանրէների կողմից և շատ կայուն է, ուստի այն լայնորեն օգտագործվում է լաբորատորիաներում։
Ինչպե՞ս որոշել IPTG-ի օպտիմալ կոնցենտրացիան։ Վերցրեք որպես օրինակ E. coli-ն։
E. coli BL21 գենետիկորեն մշակված շտամը, որը պարունակում էր դրական ռեկոմբինանտ pGEX (CGRP/msCT), ներարկվել է 50 մկգ·մլ-1 ամպեր պարունակող LB հեղուկ միջավայրի մեջ և կուլտիվացվել է գիշերը 37°C ջերմաստիճանում: Վերոնշյալ մշակույթը ներարկվել է 10 շշերի մեջ, որոնք պարունակում են 50 մկգ·մլ-1 ամպեր՝ 1:100 հարաբերակցությամբ՝ ընդարձակման մշակույթի համար, և երբ OD600 արժեքը կազմել է 0.6~0.8, IPTG ավելացվել է վերջնական կոնցենտրացիային: Այն կազմում է 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0 մմոլ·Լ-1: Նույն ջերմաստիճանում և նույն ժամանակում ինդուկցիայի ենթարկվելուց հետո դրանից վերցվել է 1 մլ բակտերիալ լուծույթ, որից հետո բակտերիալ բջիջները հավաքվել են ցենտրիֆուգացման միջոցով և ենթարկվել SDS-PAGE-ի՝ տարբեր IPTG կոնցենտրացիաների ազդեցությունը սպիտակուցի արտահայտման վրա վերլուծելու համար, այնուհետև ընտրվել է ամենամեծ սպիտակուցային արտահայտությամբ IPTG կոնցենտրացիան։
Փորձարկումներից հետո կպարզվի, որ IPTG-ի կոնցենտրացիան հնարավորինս մեծ չէ։ Դա պայմանավորված է նրանով, որ IPTG-ն որոշակի թունավորություն ունի մանրէների նկատմամբ։ Կոնցենտրացիայի գերազանցումը նաև կսպանի բջիջը։ Եվ ընդհանուր առմամբ, մենք հույս ունենք, որ որքան շատ լուծվող սպիտակուց է արտահայտվում բջջում, այնքան լավ, բայց շատ դեպքերում, երբ IPTG-ի կոնցենտրացիան չափազանց բարձր է, մեծ քանակությամբ ներառուկ կձևավորվի։ Մարմինը, սակայն լուծվող սպիտակուցի քանակը կնվազի։ Հետևաբար, IPTG-ի ամենահարմար կոնցենտրացիան հաճախ ոչ թե այնքան մեծ է, այնքան լավ, այլ որքան ցածր է կոնցենտրացիան։
Գենետիկորեն մոդիֆիկացված շտամների ինդուկցիայի և կուլտիվացիայի նպատակն է բարձրացնել թիրախային սպիտակուցի բերքատվությունը և կրճատել ծախսերը: Թիրախային գենի արտահայտման վրա ազդում են ոչ միայն շտամի սեփական գործոնները և արտահայտման պլազմիդը, այլև այլ արտաքին պայմանները, ինչպիսիք են ինդուկտորի կոնցենտրացիան, ինդուկցիայի ջերմաստիճանը և ինդուկցիայի ժամանակը: Հետևաբար, ընդհանուր առմամբ, նախքան անհայտ սպիտակուցի արտահայտվելը և մաքրվելը, լավագույնն է ուսումնասիրել ինդուկցիայի ժամանակը, ջերմաստիճանը և IPTG կոնցենտրացիան՝ համապատասխան պայմաններ ընտրելու և լավագույն փորձարարական արդյունքներ ստանալու համար:
Հրապարակման ժամանակը. Դեկտեմբերի 31-2021